慢性乙型肝炎生物治疗若干研究进展

第十二次全国病毒性肝炎与肝病学术会议专题报告

    树突状细胞（dendriticcell,DC）是起源于骨髓的专职抗原递呈细胞，具有启动T细胞介导的免疫应答功能，因其表面具有众多树突状突起而得名。DC是由美国学者Steinman及Cohn于1973年发现的。自从1992年Steinman建立了应用冲阻力细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ,GM-CSF）从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法后，人们又建立并完善了多种多种培养扩增DC的方法，这使得对DC的研究得以深入。它在感染免疫应答中具有重要作用，并在肿瘤免疫治疗、器官移植和慢性乙型肝炎的治疗中引人注目。
    成熟DC从细胞胞体的各个方面伸出约10um的突起，并具有活跃的运动能力，无或仅有微弱的吞噬功能，对玻璃或塑料缺乏持久的粘附能力。DC能表达丰富且与抗原递呈有关的MHCI类和II类分子，如HLA-DP、DQ、DR、HLA-A、B、C等，并高水平地表达多种共刺激分子，如B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、LFA-3(CD58)、ICAM-1(CD54)、ICAM-3(CD50)及CD40。这些分子介导DC与T细胞的结合并具有共刺激的功能。DC还表达CD123、CD83、CD1a、CD11C,不表达CD14分子，Fc受体低表达或缺乏。DC缺乏髓过氧化物酶和溶菌酶，而非特异酯酶阴性或仅弱阳性。上述特征表明，DC在分化过程中丧失了许多吞噬细胞所具有的功能，而获得了高水平MHC分子和共刺激分子的表达，使DC能有效地将抗原递呈给T细胞，因而DC是一种独立的细胞类型。 
    DC作为专职的抗原递呈细胞，能摄取、加工、及递呈抗原，并在缺乏其他任何刺激因子的条件下启动机体的免疫应答，因而获得天然佐剂的美名。DC与吞噬细胞在功能上的本质差别在于吞噬细胞能清除抗原，而DC则递呈抗原。 
    未成熟DC在接触抗原后首先捕获抗原，继而将抗原输送到细胞内酸性液胞区，并在该处将抗原加工为短肽，然后转运到细胞内MHCI、II类分子富集区，与新合成的MHCI、II类分子共同形成-MHC分子复合物，并表达于DC细胞表面。继而DC入血，迁徙到外周淋巴器官的T细胞聚集区，将其表面丰富表达的MHC分子上的肽类抗原递呈给T细胞，经T细胞识别后即启动MHCI类限制性细胞毒性T细胞应答和MHCII类限制性T辅助细胞的应答。此外，DC还高水平的的表达一系列共刺激分子，如CD80、CD86、CD40等，它们介导DC与T细胞结合。 
    近年来，研究者通过多种方式直接或间接恢复和增强DC的抗原提呈功能，包括：⑴ 细胞因子（IL-12、IFN-γ、IFN-α等）体内外的作用；⑵ HBsAg疫苗体内刺激；⑶优化的增强DC摄取功能的DNA疫苗；⑷DC体外诱导和抗原冲击或基因修饰后回输（DC疫苗）。
　　DC用于病毒的免疫治疗主要是通过体外病毒抗原冲击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒抗原特异性CTL，杀伤病毒感染的细胞。用抗原致敏DC的方法有多种：可通过病毒抗原肽或蛋白直接冲击DC；用灭活的病毒疫苗共同温育；还可用阳离子脂质体携带病毒gag、poc及env全部蛋白质或合成的双链RNA冲击，但最常用的方法仍然是用病毒抗原多肽致敏DC。
　　Onji领导的研究小组用含有佐剂的HBsAg疫苗治疗Tg鼠，每月注射一次，连续12个月，对照组只用佐剂。结果发现，5~6个月后血清HBsAg和HBeAg滴度开始下降，12个月后，60%~80%实验鼠转阴，HBV DNA也减少，表明该疫苗有效打破HBV耐受。但是，所有Tg鼠治疗前血清HBsAg、HBeAg和DNA滴度均相同，而部分却没有对疫苗发生反应。　　进一步研究证实，Tg鼠DC非常异质，其中DC功能相对较好者对疫苗治疗有反应，而较差者则无反应。因此，诱导DC活化是疫苗治疗作用的关键，治疗前Tg鼠DC的功能对疫苗治疗结果有预后作用。
　　最近，该研究小组通过两次腹膜内注射与HBsAg共培养24h的脾脏DC疫苗，结果所有Tg鼠血清HBsAg均转阴，并出现抗-HBs，而其他实验组（单纯DC疫苗；HBsAg疫苗；佐剂对照等）都未出现该结果。
　　有研究发现乙肝疫苗接种能活化DC，DC的活化程度较HBV血清学标记物（如HBsAg、HBeAg，等）更有助于预测HBV携带者接受疫苗治疗的效果。以HBV转基因小鼠为研究对象，对性别、年龄、MHC背景完全相同的60只转基因小鼠随机分为三组：疫苗治疗组腹腔注射完全弗氏佐剂（CMF）乳化的乙型肝炎疫苗，安慰组注射CMF，对照组不予处理。各组在注射前血清HBsAg、HBeAg滴度均相同。在疫苗注射结束后（每月注射1次，连续注射12个月），治疗组35只转基因小鼠中有22只HBsAg、HBeAg完全转阴，抗HBs显著提高，安慰剂组与对照组HBV血清学标记物滴度则无显著变化。由于疫苗治疗的效果还依赖于宿主的应答性，通过观察淋巴细胞对多克隆有丝分裂原的增殖反应以及免疫球蛋白得产生，证实了其应答性在对照组、疫苗治疗组中的有反应者和无反应者蛋白质几乎完全相同，从而排除了宿主淋巴细胞对免疫治疗有直接的影响。进一步的研究发现，疫苗治疗的应答同接受前DC的功能有关。在DC功能良好的23只转基因小鼠中，其HBsAg、HBcAg在疫苗治疗后完全转阴，且HBVDNA水平下降；而DC功能不良的19只则完全没有应答。此外，DC功能良好的小鼠，其DC有MHCII、CD86表达的上调及IL-12产生的增加，该研究提示，可通过DC的活化来预测疫苗治疗的效果。
　　还有人通过小鼠皮下或肌肉注射携带编码病毒抗原基因的裸质粒DNA，也能激发抗病毒的T细胞免疫，其机制可能是使宿主细胞合成外源基因编码的蛋白质，然后被DC摄入、处理和递呈，或者DC摄入质粒，然后合成和处理并递呈外源基因产物。
　　Shimizu等以HBsAg质粒DNA或BMDC免疫五个品系的HBV Tg鼠，试图在B细胞和T细胞水平打破耐受。结果DNA免疫只诱导了抗-HBs，没有产生特异性CTL；而DC免疫诱导了HBs28-39特异的CTL应答。但是，两种免疫方法均未引起肝细胞炎症及HBV DNA复制抑制，因此认为还需更有效的免疫策略刺激足够强的免疫应答以获得抗病毒的免疫效果。Stober等用HBsAg颗粒体外冲击BMDC及源于脾脏和肝脏的DC，也发现HBsAg能有效进入DC的任何加工途径，并能提呈表位给MHCⅠ类分子限制的特异性CTL。类似方法在临床上也体现了效果。Li等把19位慢性乙肝病人的PBDC体外用HBsAg冲击后皮下注射自体回输，结果有10人血清HBeAg清除，5人有HBeAg/抗-HBe血清转换，HBV DNA拷贝数下降，2名联合用拉米夫丁的病人有完全临床反应，而且ALT水平异常或正常的病人对DC治疗的反应相同。
　　DNA疫苗虽然可诱导体液免疫和细胞免疫，但由于体内只有十分有限的DNA分子被DC摄取，影响了其免疫效果。You等设计了能表达HBeAg和IgG Fc融合蛋白的DNA疫苗，通过体内表达的IgG Fc和DC表面FcγR结合，促进DC捕获和处理HBeAg的能力，能普遍增强CD4+Th、CD8+CTL和B 细胞应答。
　　由于MHC-肽复合物半衰期较短，其寿命决定了CTL反应的效率，因此要保持高水平而持久的抗病毒免疫应答需用致敏的DC重复刺激机体。为使DC能持续地递呈病毒抗原多肽，可将病毒抗原多肽基因导入DC，使DC表面能持续表达基因产物，从而有效地诱导出特异性T细胞应答。为达此目的，必须有适合的基因载体。有人将编码荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因的质粒DNA通过聚乙烯亚胺（PEI）结合于腺病毒微粒（Ad）上，转染入DC，发现Ad-PEI-DNA转染复合体产生较高的转导水平，并且能持续表达荧光素酶和绿荧光素蛋白受体基因产物。这种DC也能刺激同种和自体混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖，并且可以抗原特异方式激活T细胞，因为DC表面也有甘露糖受体的高表达。
　　还有人用甘露糖组成Mam-PEI-DNA复合体，通过甘露糖受体介导和内吞作用转染DC,发现这种复合体传递基因不如Ad-PEI转染有效，而Mam-PEI-DNA转染复合体结合腺病毒则能更进一步增强转导效率和转基因表达，提高病毒基因传递系统的转导效率较非病毒系统更高。其他的载体还有逆转录病毒、疫苗病毒、阴离子蛋白体，或以电穿孔法导入基因。目前认为，腺病毒较其它病毒爱踢能产生更高的转染效率。
　　另外，Ding等以逆转录病毒为载体给小鼠BMDC转导HBc基因，发现该基因修饰的DC皮下免疫C57BL/6小鼠，能诱导比HBcAg免疫更强的Th1和特异性CTL应答。Hu等用重组腺相关病毒（rAAV）介导HBsAg基因感染人PBDC，同样证实该DC比处女DC在刺激Th1分化上更有效，但DC的表型、IL-12产生等功能不受影响，提示这种DC疫苗可应用于HBV感染的免疫治疗。
　　有人将编码肿瘤抗原的基因转入DC和成纤维细胞，并与标准的遗传免疫进行比较，一次注射500~1000个转基因DC就可以达到标准遗传免疫的效果，而这需要注射至少50倍的转基因成纤维细胞。因此，少量的DC便可激活大范围的免疫应答。
　　我们研究所最近的研究结果表明，Ad-S转导的DC能诱导比HBsAg蛋白冲击DC及DNA疫苗更强的I型免疫应答和特异性CTL免疫，对HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏组织HBcAg和HBsAg的表达有较迅速和明显的抑制作用。
　　目前的研究报道，从慢性乙型肝炎患者的外周血中分离DC，体外扩增同时用匙孔血蓝蛋白和HBsAg等进行刺激，7~9d后回输，试治疗慢性乙型肝炎，结果表明此疗法可促使HBeAg、HBVDNA阴转，肝功能趋于稳定。