第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心

王全楚  冯志华  周永兴

世界华人消化杂志，2003年，第11期，第6卷:815-818

[摘要]

树突状细胞(dendriticcell，DC)是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞，在免疫反应中起着举足轻重的作用，因此备受重视。1990年以来，人们在体外诱导扩增DC成功之后，克服了以往由于DC在组织中含量很少、难以获取的困难，使DC研究取得了许多突破性的进展，为人们探索新的疾病防治手段开辟了新的天地。以下从树突状细胞的特性、体外诱生及以DC为基础的治疗性疫苗在抗HCV感染中的作用等三个方面作一综述。

丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前危害人类健康的重要传染病，至今尚无特异性的预防和治疗措施^[1-20]。基因疫苗作为一种控制HCV感染的新途径，正在受到人们的重视^[21]。丙型肝炎基因疫苗诱导的特异性免疫应答已被大量的实验室证实。但普遍存在着抗体滴度不高，CTL杀伤率不强等问题。其原因可能与HCV感染后，抗原提呈细胞(APC)，尤其是树突状细胞(DC)数量减少、功能降低有关^[22-24]。如何绕过或提高DC免疫功能低下，诱导出更强有力的、更具广泛性的免疫应答，应当成为基因疫苗和免疫治疗亟待解决的问题之一。利用基因修饰或抗原致敏的树突状细胞作为疫苗具有最强的抗原呈递能力，可广泛用于肿瘤和感染性疾病的免疫治疗，其诱导的强烈的CTL反应在HCV基因治疗中具有很好的应用前景^[25-40]。

1 DC的特性和体外诱生

1.1 DC的特性 树突状细胞最先由Steinman和Cohn在1973年描述。Steinman阐述了DC与功能相关的几大特性:(1)DC具有捕获加工处理抗原的能力；(2)DC高表达MHCII类产物(>10⁶/细胞)；(3)DC表达丰富的黏附分子及共刺激因子，如ICAM、LFA-3、整合素、B7、CD40、IL-12等，这些表面标志随DC的不同分化阶段而有变化；(4)DC具有显著区别于其他细胞的表面标志。活化的DC不表达T细胞、B细胞和单核/巨噬细胞的典型表面标志，却表达CD83、S100、CD40、CD80、CD86、CD1a、CD11a、CD45、HLA-ABC和HLA-DR、HLA-DQ^[41,42]等。根据DC的异质性，有人将其分为髓系和淋巴系两大类.不同的DC担负着不同的使命。胸腺髓质中的DC参与胸腺中T细胞的阴性选择，髓系DC对T细胞免疫反应可产生强烈的刺激作用，并可分泌IL-12，调节T细胞和NK细胞功能，促进Th0朝Th1方向分化，显著影响Th1和Th2的平衡。DC在外周性免疫耐受中也起重要作用。淋巴系DC倾向于促进Th2分化，并可递呈源自凋亡细胞的肽片段，据此，DC可通过递呈来自体细胞的自身抗原给T细胞而诱导对自身蛋白的耐受。迁移中的髓系DC，包括LC，在遭遇外源抗原后产生活性，移向淋巴器官启动免疫反应^[41]。DC对B细胞的生长和免疫球蛋白的分泌有重要作用。二者虽同为APC，但DC有较高MHC及共刺激因子的表达，并能大量产生IL-12；DC通过Fc及多聚凝集素(multilectin)受体中和抗原，B细胞则有抗原特异性免疫球蛋白受体。DC同时调控着B细胞所产生的免疫球蛋白的种类，IL-10与TGF-b诱导IgA1的生成，IgA2的表达则严格依赖于B与DC的直接相互作用，这说明DC控制着黏膜的免疫。滤泡型DC直接维持激活B细胞的活力、生长与分化，生发中心含有CD11c⁺DC，他可携带免疫复合物，有较强的刺激B细胞的能力。DC与B细胞间作用方式也遵循双信号原则，即DC上的特异性抗原被BCR接受产生第一信号，DC上CR2L与B细胞上CR结合，这对共刺激因子提供第二信号调控体液免疫。总之，DC对T、B细胞的生长分化、抗病毒和抗肿瘤免疫以及免疫耐受等方面均有重要作用。

1.2 DC的体外诱生 体外诱生DC有许多不同的方案。骨髓、脐血和外周血干细胞、外周血单核细胞，都可以作为前体来诱导分化为DC^[43]，奥地利学者甚至提出乳铁传递蛋白(Lactoferin)阳性的中性粒细胞在体外也可转型为DC。用不同的起始细胞群诱生DC需要不同的培养条件。用CD34-细胞诱生DC时，去掉非贴壁细胞可显著降低淋巴细胞的污染。CD14⁺单核细胞在合适的条件下也可分化为DC^[42]。尽管用不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GM-CSF似乎是必不可少的.GM-CSF可诱导DC前体扩增，促使其分化，并可在体外维持DC存活达6wk。IL-4往往与GM-CSF同时使用，特别是将外周血单个核细胞或单核细胞作为前体时。IL-4可抑制巨噬细胞克隆形成，诱导DC生长和成熟。当用骨髓或脐血CD34⁺细胞作前体时，则用TNF-a代替IL-4.TNF-a可降低粒细胞的产生，上调细胞GM-CSFb链的表达，增强其对细胞因子信号的反应能力.许多其他细胞因子也被证明对DC的产生具有促进作用^[44-47]，如IL-13，SCF，TGF-b1等。有报道向用GM-CSF、TNF-a和IL-4刺激的骨髓CD34⁺细胞培养体系中加入Flt3配体可使DC的收获率提高5倍，再加入SCF可进一步提高。持续的流动灌注培养体系可进一步增强DC的扩增。甲胎蛋白对DC可产生抑制作用，下调共刺激分子的表达；IL-10可以抑制DC的分化，将未成熟DC转化为可诱导产生耐受的APC，这也许可成为治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病的有效方法。LPS、PGE₂、含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG-ODN)等免疫调节因子可以促进DC成熟从而增强抗原提呈功能。不同的前体细胞，不同的细胞因子和培养条件可以改变DC的表型和功能。GM-CSF和IL-4有利于髓系DC分化，而IL-3促进向淋巴系DC分化。CD40L则对两种DC的成熟都有促进作用^[42]。虽然目前已有的方法可以扩增出一定数量的DC，但不足之处是方法复杂，所需细胞因子的量较大，培养时间长，成本高。所以，DC大量扩增方法学的优化也是下一步研究的关键问题。

2 DC 在HCV发病机制中的作用

近年来，越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫特别是CTL介导的免疫反应，在机体抵御恶性肿瘤和传染性疾病中发挥着十分重要的作用。而且最近DC疫苗的临床Ⅰ、Ⅱ期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在恶性肿瘤等疾病中的巨大前景。目前研究认为，细胞免疫因可识别和清除病毒感染，故对HCV的清除起重要作用。HCV感染早期T细胞反应的强度、表位特异性和细胞因子分泌情况等很可能将决定感染的预后。HCV感染时，除病毒感染的非造血细胞外，淋巴结和骨髓来源的DC作为专职抗原提呈细胞也直接参与启动抗病毒T细胞应答^[8]。

Auffermann-Gretzinger et al ^[49]研究发现慢性丙型肝炎患者外周血DC经同源刺激后不能分化成熟，其膜表面分子仍为未成熟型，虽能摄取抗原，但不能呈递抗原。自限性 HCV感染者DC功能跟正常人一样可以分化成熟。提示DC 抗原呈递能力下降可能是导致持续感染慢性化的原因之一。Bain et al ^[50]报告HCV感染者外周血DC虽然形态及摄取抗原能力正常，但刺激T细胞增生能力较正常人明显降低。用RT-PCR 检测DC培养液中HCV病毒极其准种，6例中5例可检测到HCV RNA阳性。其中1例DC中HCVRNA序列不同于血清、肝脏及其他部位，提示HCV引起的DC刺激能力下降可能由于DC本身储存病毒所致。Kakumu et al ^[51]观察HCV和HBV引起的原发性肝癌(HCC)中DC分泌IL-12以及T细胞刺激能力下降。21例HCV、5例HBV所致的HCC均可见DC功能下降。Kanto et al ^[48]发现HCV感染所致的DC功能下降可被HCV核心区抗原刺激后恢复。作者发现24例慢性丙型肝炎患者DC刺激前CD86、IFN-γ的表达以及T细胞刺激能力均低于正常组DC。但核心区抗原刺激后DC可持续T细胞增生能力

3 抗HCV树突状细胞疫苗的制备方法

DC疫苗包括病毒特异性抗原负载的DC疫苗和特异性抗原基因导入的DC疫苗两种，前者为增加DC的抗原呈递功能，将病毒特异性的抗原负载到DC细胞或体外致敏DC制成特异性DC疫苗或瘤苗，在抗肿瘤免疫中已取得较好效果。用同样的方法治疗肝炎也取得相似结果。如将HBsAg致敏的DC转入H-2小鼠体内，可诱导MHC-限制的HBsAg特异性CTL反应^[52]。Bocher et al ^[53] 用BALB/C小鼠全身致死性照射后植入SCID小鼠骨髓以支持快速植入PBMC制成可感染HBV或HCV的动物模型，用上述模型来研究抗原HBcAg负荷的DC疫苗诱发了强烈的针对HBc的原发性Th细胞反应和特异性CTL反应。由于基因转染的DC疫苗能提供更多更有效的可供识别的抗原表位，而且可以最终克服HLA限制，已成为最具发展前景，备受人们关注的研究热点。目前在基因转染DC的方法上人们已经进行了许多探索，将特异性抗原基因导入DC的方法有如下几种。

3.1 DNA转染DC 虽然裸DNA转染DC 的效率较低，但仍然有几个研究小组在不断探索^[54]。采用基因枪轰击的方法法将编码HPV-16E7的质粒导入鼠骨髓来源的DC，将存活的转基因DC免疫小鼠后，不仅在体内产生抗原特异性的CTL反应，而且还引起随后对致死量HPV-16转化的肿瘤细胞攻击的排斥.采用电击法和脂质体介导的方法将pEGFP质粒分别导入CD34+来源的DC(PC-DC),郎汉斯细胞(PC-LC)和CD14来源的DC(Mo-DC)，实验结果表明^[55]，脂质体介导法对3种DC几乎无效，而电击法的转染效率分别为PC-DC12 %，PC-LC16%，Mo-DC2%。

3.2 重组腺病毒介导的转染 近年来的研究表明重组腺病毒介导的转染效率比裸DNA转染DC的效率高^[56]。90 %的鼠骨髓来源的DC能有效转染Ad(γ-gal)，但研究发现，直接用AdRSVGFP转染人外周血DC，只有大约20%的DC表达GFP，加用脂质体后，转染效率可高达90%，说明脂质体可以增强腺病毒介导的基因转染DC的效率^[57]。使用腺病毒载体作为基因转移载体来制备疫苗，遇到的主要问题是病毒本身基因的表达成为潜在的免疫原，尽管动物实验表明，反复注射病毒转染的DC，仅仅产生低滴度的中和抗体.利用适度的紫外线照射重组腺病毒，既不改变腺病毒结合受体的结构和进入细胞的能力，又能封闭腺病毒本身基因的转录，随后用Poly(L-lysine)共价结合紫外线照射的腺病毒，结果高效地将外源基因转入DC，且没有共存的腺病毒基因的表达，这为DC疫苗的制备提供了一种更加安全的方法^[58]。

3.3逆转录病毒介导的基因转染 与腺病毒载体不同的是，逆转录病毒能将被转移的外源基因整合到转染细胞的基因组中去，使之得到有效和稳定的表达.目前，一些实验已证明，利用逆转录病毒将TSA基因导入鼠和人的DC是可行的。如用MFG 逆转录病毒系统将LacZ基因转入人外周血DC，7d后，35-67 %的DC显示出较高的?-gal活性，20d后PCR依然能检测出LacZ基因的存在，表明LacZ基因已稳定整合于DC基因组中，另外逆转录病毒转染的DC依旧保持着DC的生物学特性，并能诱导产生抗原特异的CTL^[59]。

3.4重组痘病毒介导的基因转染DC 重组痘病毒介导TSA基因转染DC具有转染率高、基因表达快、培养时间短等特点。重组痘病毒转染的DC也能产生抗原特异性CTL。重组痘病毒介导的黑色素瘤相关抗原基因MART-1转染DC后，接种于黑色素瘤患者，结果在患者体内产生MART-1特异性的CTL反应，显示出重组痘病毒在制备DC疫苗上的巨大潜力^[60]。

3.5DNA疫苗直接转染DC 尽管DNA疫苗仅能直接转染较少一部分的DC，但是实验已发现在引流淋巴结的DC被广泛激活，从而为效应细胞的活化提供了最佳的条件。因此DNA疫苗若以DC为载体能得到良好的免疫效果。

总之，树突状细胞系统作为机体内免疫反应的始动子和调节子，具有激活CD8+CTL及CD4+T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，因而他已成为抗肿瘤和抗病毒免疫反应的中心环节。近几年来，有关DC系统及其抗肿瘤疫苗的实验研究取得了显著的进展，促进了DC疫苗在部分肿瘤患者体内的Ⅰ，Ⅱ期临床研究的深入，但是在抗病毒免疫方面尤其是抗肝炎病毒的免疫治疗方面尚处于开始阶段，随着DC研究的深入，体外获得大量的DC和制备DC疫苗的技术日趋成熟，特别是可以针对每个患者制备特异的DC疫苗，从而进行特定的免疫学治疗。相信上述DC疫苗在不久的将来可能成为病毒性肝炎临床治疗的一种不可缺的辅助手段。

4 参考文献(略)